Mikroskopia fazowa z wykorzystaniem ciekłokrystalicznych siatek dyfrakcyjnych i kamery polaryzacyjnej

kierownik projektu: dr inż. Piotr Zdańkowski

okres realizacji zadania: 23.11.2022- 22.11.2023 (12 miesięcy)

przyznane środki na realizację zadania: 49 995 PLN

Bezznacznikowe metody obrazowania wykorzystują różne endogenne środki kontrastowe, np. absorpcję wewnętrzną, rozpraszanie lub współczynnik załamania światła (RI). Znane i szeroko rozpowszechnione techniki mikroskopii optycznej, wykorzystujące fazę komórki jako środek kontrastowy, to mikroskopia kontrastu fazowego Zernike'a i mikroskopia różnicowego kontrastu interferencyjnego, ale dostarczają one jedynie informacji jakościowych i są obarczone artefaktami (niski kontrast obrazu i efekt „halo”). Ilościowa mikroskopia fazowa (QPM) może być traktowana jako rozszerzenie technik kontrastu fazowego. QPM dostarcza mierzalnych informacji o fazie próbki, bez konieczności dodawania zewnętrznych markerów. Wykazano już jej przydatność w biomedycynie.

Bezznacznikowe obrazowanie uzyskuje się dzięki wewnętrznemu kontrastowi próbek – elementy wewnętrzne próbki wprowadzają inne opóźnienie optyczne przechodzącego przez nią światłą. To opóźnienie optyczne jest następnie odzyskiwane poprzez numeryczną konwersję interferogramu na precyzyjne w nanoskali subkomórkowe mapy 2D/3D/4D badanej próbki. Ta niefotototoksyczna, nieniszcząca technika obrazowania zbliża biologię i metrologię, ponieważ generuje ilościowe mapy żywej biostruktury (np. masy komórek, objętości, powierzchni i ich zmian w czasie), unowocześniając wizualizację próbki i umożliwiając bezznacznikowe, nieinwazyjne pomiary optyczne, pozwalające na precyzyjną diagnostykę.

HeLa5page

 

Projekt ma na celu ilościową analizę procesów fizjologicznych żywych komórek w naturalnym środowisku bez etykiet, bez zewnętrznego barwienia i szkodliwych dawek światła, z wykorzystaniem nieuszkadzającego światła o niskiej koherencji (lub nawet niekoherentnego). Naszym celem jest opracowanie prostego w budowie modułu QPM, możliwego do zastosowania w dowolnym mikroskopie świetlnym.

Metody obrazowanie fazowego tradycyjnie oparte są na klasycznych systemach interferometrycznych, takich jak interferometr Macha Zehndera (ponieważ komórki są przezroczyste i preferowana jest konfiguracja transmisyjna). Geometria interferometryczna z oddzielnym ramieniem referencyjnym jest jednak nieporęczna, wymaga dodatkowych elementów optycznych do rozdzielania i rekombinacji wiązki, sterowania wiązką, ma znacznie ograniczoną stabilność i wymaga laserowego źródła światła (duże długości koherencji), co prowadzi do wysokiego szumu plamkowego i jest wysoce niekorzystne dla żywych komórek. Układ interferometryczny o wspólnej drogi może być rozwiązaniem niektórych z tych problemów, ponieważ jest niewrażliwy na zakłócenia mechaniczne, ma prostą budowę i niższy koszt w porównaniu z układami wykorzystującymi wiązkę referencyjną. W interferometrach wspólnej drogi dwa fronty falowe są bardzo nieznacznie przesunięte względem siebie (zaledwie o kilka pikseli). Gdy przesunięcie czół falowych zbliża się do zera interferogram niesie informację o pochodnej cząstkowej rozkładu fazowego próbki wzdłuż kierunku rozdwojenia. Aby odzyskać pełną informację fazową, konieczne jest uzyskanie częściowej przestrzennej pochodnej fazy przynajmniej w dwóch ortogonalnych (np. x i y) kierunkach.

W ramach projektu Miniatura 16 planowane jest opracowanie systemu ilościowego mikroskopu fazowego z pojedynczym interferogramem, opartego na siatkach polaryzacyjnych (PG) i kamerze CMOS z filtrem polaryzacyjnym (która będzie używana do uzyskania 4 przesuniętych fazowo interferogramów w pojedynczej ramce). Dodatkowo planowane jest potencjalne rozszerzenie ilościowych modalności kontrastu systemu QPM na właściwości polaryzacyjne próbki, tj. anizotropowość próbki i trójwymiarową orientację dipoli polaryzacyjnych. PG daje ponieważ wytwarzają ona tylko 2 rzędy dyfrakcyjne (-1. i +1.), o przeciwnych polaryzacjach kołowych. Siatki takie mogą być dostosowane do potrzeb pod względem np. okresu czy rozmiaru. Zasada działania i konstrukcja układu są pokazane na Rys. 1.

Zdjęcie 1

 Rys. 1. Proponowany układ QPM oparty na PG

 

Poprzez zastosowanie kamery polaryzacyjnej CMOS oraz PG, możemy w prosty sposób uzyskać w jednej ramce 4 przesunięte w fazie interferogramy (ponieważ wiązki docierające do detektora mają przeciwnie skrętne polaryzacje kołowe, a polaryzatory liniowe na detektorze CMOS dadzą 4 przesunięte w fazie ramki). Umieszczając siatkę bezpośrednio przed matrycą możemy w łatwy sposób otrzymać rozdwojenie czół falowych rzędu zaledwie kilku pikseli: dla siatki o okresie 200 µm i rozmiarze piksela 3.45µm umieszczając siatkę w odległości 1 mm od matrycy otrzymamy przesunięcie rzędu 1.85 piksela. Stosując siatkę o małym okresie możliwe jest obrazowanie fazowe obiektów o bardzo wysokich częstościach przestrzennych, ponieważ przy tak małym rozdwojeniu czół falowych, rozdwojenie to jest mniejsze niż teoretyczna rozdzielczość opisana przez limit dyfrakcyjny. Do akwizycji dwóch ortogonalnych gradientów fazowych zostaną użyte dwie PG oraz dwa polaryzacyjne detektory CMOS. Dzielnik wiązki wygeneruje dwie niezależne wiązki, przy czym PG będą umieszczone w pozycji obróconej o 90 stopni w stosunku do siebie.