[PHAICELL] Koherentna mikroskopia z ilościowym kontrastem fazowym: powrót do podstaw i zaproponowanie nowej techniki numerycznej rekonstrukcji z zastosowaniem do zaawansowanego obrazowania biomedycznego bez znaczników

Koherentna mikroskopia z ilościowym kontrastem fazowym (ang. Quantitative Phase Microscopy, QPM) wyróżnia się wśród nowoczesnych technik obrazowania bez znaczników, jako niezwykle wydajna metoda o wysokim kontraście. "Bez znaczników" oznacza, że próbka nie jest poddawana barwieniu ani znakowaniu fluorescencyjnemu i może być obrazowana w oparciu o endogenne środki kontrastowe, tj. współczynnik załamania światła (wprowadzający mierzalne zróżnicowane opóźnienie fazy optycznej). Ta niefototoksyczna, nieinwazyjna technika obrazowania zbliża do siebie biologię oraz metrologię, ponieważ generuje ilościową mapę żywej próbki biologicznej (masy komórkowej, objętości, powierzchni i ich ewolucji w czasie), ulepszając wizualizację próbki do jej bez-znacznikowego pomiaru optycznego umożliwiającego precyzyjną diagnostykę.

Rysunek nr 1. Badania komórek HeLa metodą QPM: (a) interferogram zarejestrowany w układzie mikroskopu Linnika, (b) spektrum interferogramu z kłopotliwie pokrywającymi się członami informacyjnymi wrysowanymi kolorem żółtym, (c) rekonstrukcja ilościowego rozkładu fazy autorską metodą numerycznej super-rozdzielczości opracowaną na PW, (d) rekonstrukcja, dużo uboższa w szczegóły struktury komórkowej, przeprowadzona tradycyjną metodą transformacji Fouriera (utrata rozdzielczości fazowej spowodowana jest częściowym pokryciem informacji w spektrum). Badania zrealizowano we współpracy z The Arctic University of Norway (grupa prof. Balpreeta Ahluwalii).

Problem, który chcemy zbadać w ramach projektu PHAICELL związany jest z faktem, że QPM bardzo szybko przeszła do fazy rozwoju zorientowanego na zastosowania, podczas gdy nadal istnieją fundamentalne ograniczenia ilościowego obrazowania fazowego, które należy zbadać. Ponadto, w oparciu o badanie tych ograniczeń, opracowane 

zostaną nowe techniki numerycznej rekonstrukcji mapy fazowej, które będą w stanie pokonać wybrane przeszkody w obecnie dostępnych systemach QPM, np. ograniczona zawartość informacyjna wpływająca na obniżoną rozdzielczość. Oprócz tych fundamentalnych i numerycznych badań, w ramach projektu PHAICELL zostaną sprawdzone nowe zastosowania eksperymentalne.

Rysunek nr 2. Schemat PWskopu – nowoczesnego mikroskopu zaprojektowanego na planie interferometru wspólnej drogi wykorzystującego siatkę dyfrakcyjną do achromatycznej generacji ilościowego kontrastu fazowego.

Przewiduje się, że badania te pozwolą na opracowanie narzędzi obrazowania umożliwiających ważne postępy w biomedycynie, a w szczególności

• w neurobiologii i analizie komórek macierzystych, które planujemy badać z naszymi partnerami z Instytutu Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej (IMDiK);
• analizie plemników, którą będziemy prowadzić we współpracy z naszymi partnerami z Uniwersytetu w Walencji (UVLC);
• w badaniach komórek ryb zanieczyszczonych mikroplastikiem, prowadzonych z naszymi partnerami z Norweskiego Uniwersytetu Arktycznego w Tromso (UiT).

Rysunek nr 3. Autorski układ fourierowskiego mikroskopu ptychograficznego realizującego pomiary QPM z numerycznie zwiększoną rozdzielczością przy zachowaniu szerokiego pola widzenia. Zaprezentowano wyniki obrazowania amplitudowego dla podstawowej rozdzielczości wynikającej z parametrów obiektywu oraz wyniki obrazowania fazowego dla zwiększonej ptychograficznie rozdzielczości (obiektem badań były komórki nabłonka policzków).

Należy zauważyć, że wspólne prace z IMDiK będą prowadzone z wykorzystaniem zmodyfikowanego siatkowego mikroskopu fazowego wspólnej drogi – tzw. PWskop 2.0. Oryginalna wersja tego nowatorskiego mikroskopu została zbudowana w Instytucie Mikromechaniki i Fotoniki PW podczas bardzo udanego projektu OPUS 13 (PI: Maciej Trusiak) i stanowi unikalny na skalę światową mikroskop fazowy o niespotykanej kompaktowości. W ramach projektu PHAICELL planujemy zmodernizować PWskop pod względem numerycznym i doświadczalnym oraz wykonać jego prototyp z wykorzystaniem technologii druku 3D i przeprowadzić instalacje w UiT i UVLC, aby ułatwić lokalne badania interesujących próbek biologicznych.

Rysunek nr 4. Badanie typu time-lapse (poklatkowe) obumierającej mezenchymalnej komórki macierzystej z wykorzystaniem PWskopu: (a)-(c) zarejestrowane interferogramy, (d)-(f) obliczone rozkładu amplitudy (odpowiadające absorpcji komórkowej), (g)-(i) rozkłady ilościowego kontrastu fazowego (odpowiadające rozkładowi współczynnika załamania struktury komórkowej); obrazy (a) (d) (g) zarejestrowano na początku badania, obrazy (b) (e) (h) zarejestrowano po godzinie badania, zaś obrazy (c) (f) (i) zarejestrowano po upływie 2,5h.  Badania zrealizowano we współpracy z Instytutem Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN (grupa prof. Barbary Łukomskiej).

W projekcie PHAICELL dążymy do zbadania, zdefiniowania i pokonania granic QPM w zakresie szybkiego obrazowania w reżimie ograniczonego budżetu fotonów, dużego zaszumienia rejestrowanych interferogramów i silnej absorpcji obiektów biologicznych. Na całym świecie zauważalna jest silna potrzeba wypełnienia wskazanych luk w technologii QPM. Podkreśla to rosnąca liczba publikacji naukowych w prestiżowych czasopismach o dużym zasięgu i popularność produktów komercyjnych (np. Nanolive). PHAICELL będzie wykorzystywał zaawansowane techniki zarówno w pracach eksperymentalnych, tj. zastosowanie pseudotermicznych źródeł światła, specjalnie skonstruowanych falowodów i unikalnego mikroskopu fazowego PWskop 2.0, jak i w działaniach numerycznych, tj. zastosowanie m.in. nowej adaptacyjnej lokalnej filtracji iteracyjnej i dekompozycji wariacyjnej. Dzięki nowatorskiej metodyce PHAICELL będzie starał się istotnie zaawansować obecny stan wiedzy w zakresie QPM i umożliwić szybkie, nieinwazyjne obrazowanie biologiczne przy niskiej intensywności światła z ograniczonym sygnałem i zwiększoną dokładnością kontrastu fazowego. Współpracownicy w dziedzinie biomedycyny zapewnią aktualność ambitnych zastosowań.

Rysunek nr 5. Badania nanocząsteczek złota (100nm średnicy): (a) widmo interferogramu z wrysowaną aperturą numeryczną i wyraźnie zaznaczonym aliasingiem (pokrywaniem się) informacji spektralnej, (b) rozkład fazy otrzymany z wykrzystaniem tradycyjnej metody transformacji Fouriera, (c) rozkład fazy otrzymany z wykorzystaniem autorskiej metody Hilberta-Huanga, (d) rozkład fazy otrzymany z wykorzystaniem autorskiej metody wariacyjnej transformacji Hilberta. Poprawa rozdzielczości ilościowego obrazowania fazowego jest znaczna i silnie zależna od algorytmu rekonstrukcji mapy fazowej (badany był ten sam interferogram). Badania zrealizowano we współpracy z The Arctic University of Norway (grupa prof. Balpreeta Ahluwalii).